• 系列文章——ERGIC与自噬起始(一)

    2016年,诺贝尔医学或生理学奖颁发给了大隅良典(Yoshinori Ohsumi),让细胞自噬成为了真正的研究热点。细胞自噬的发现不全是大隅良典的功劳,实际上,从细胞自噬现象的发现到分子模型的完善历经了近60年时间【1】。“九层之台,起于累土”,现如今,多种神经退行性疾病(帕金森、阿尔茨海默症、渐冻症)和自身免疫病被发现与自噬缺陷密切相关,自噬相关的基因甚至参与众多非自噬过程(非经典蛋白质分泌、外泌体产生、胞吞、病毒入侵等),确立自噬现象在生命科学中的重要地位【2】。

    经典自噬途径需要经历以下步骤【2】:

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    1. 细胞压力导致上游起始信号激活(抑制mTOR复合物、JNK 和AMPK的激活等),将信号传递至ULK复合物(由ULK1/2,A,FIP200和A)。
    2. ULK复合物促进Beclin复合物(由Beclin1,A,VPS34和VPS15组成)组装。ULK复合物负责辅助生物膜上磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)的合成,为PI3P结合蛋白提供锚定位点(如DFCP1和WIPI2)。
    3. PI3P将PI3P结合蛋白们招募到自噬泡前体上,其中包括WIPI2(能够招募A)【2】
    4. 类泛素连接酶系统将类泛素蛋白A,A-A,形成类E3-连接酶复合物。A-A-A,激活A,A-I与自噬泡上的磷脂酰乙醇胺结合。脂化LC3可以辅助自噬泡的闭合,也可以作为一些货物蛋白的锚定位点。自噬泡闭合后形成了具有双层膜结构的成熟自噬体。
    5. 成熟自噬体在后续一系列蛋白质的帮助下与溶酶体融合,发挥降解蛋白质、细胞器的作用。

    如果有的朋友读得仔细一点,就会发现ULK复合物应当是在自噬泡(未成熟的自噬体,单层膜结构)或自噬泡前体膜上发挥作用,因为PI3P的合成是自噬体形成早期的重要信号。但是我们并不清楚自噬泡的生物膜究竟是从哪里来的?不搞明白这个问题,我们就无从得知自噬起始信号诱导自噬发生的具体机制。

    考虑到细胞内膜系统之间的联系十分紧密,在细胞内鉴定自噬泡的膜来源需要排除众多干扰因素。

    2013-2017年,Randy Schekman实验室(霍华德·休斯医学研究所,加州大学伯克利分校)发表了一系列文章,主要利用两种体外模拟实验逐步证明ERGIC(Endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment)是自噬泡的重要膜来源。这一系列研究工作构思精妙,逻辑严谨,值得我们好好学习。

    首先是发表于2013年的第一篇文章——《The ER-Golgi intermediate compartment is a key membrane source for the LC3 lipidation step of autophagosome biogenesis》【3】。

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    一、体外LC3脂化实验模拟细胞内的自噬起始过程

    研究者设计了一个体外模拟自噬起始的实验:LC3的脂化作为自噬起始的鉴别因子,从LC3-II生成缺陷的Atg5 KO MEF(mouse embryonic fibroblast)中分离获得不同来源的生物膜(只含有LC3-I),将生物膜与WT(wild type)细胞的细胞质(只含有LC3-I,LC3-II随着膜组分在离心过程中舍弃)混合,在合适条件下孵育一段时间,测定生成的LC3-II以判断自噬是否起始成功。假如LC3-II生成成功,说明加入的生物膜与自噬起始有关。

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    首先研究者先测试了图1B体系的工作情况,内源性LC3-II随孵育时间增加而增加。LC3-II的合成还依赖反应体系中的ATP和GTP,生成的LC-II对碳酸钠和尿素处理有抵抗能力,但可以被A(LC3-II的一种半胱氨酸蛋白酶,负责LC3-II的脱脂化),表明生成的LC3-II与内源性LC3-II具有相似的生物化学特性。

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    饥饿可以诱导自噬发生。研究者还检测了体外实验体系对饥饿处理的敏感度(取处理细胞的细胞质),饥饿处理提升了LC3-II的合成能力(约3倍)。同时,胞质的A-II的完全消失,表明胞质A-II的合成至关重要。

    为了进一步验证LC3体外脂化实验的合理性,研究者调节自噬上游信号,如抑制PI3K的激活(3-methyladenine 和wortmannin),还在体系中添加PI3P竞争性结合肽(FYVE domain peptide),结果发现种处理均剂量依赖性地抑制了LC3-II的生成。

    由于内源性LC3-I的丰度往往达不到要求,研究者直接在体系中添加重组的T7-LC3(aa1-120),这种形式的LC3蛋白可以直接被脂化,不需要进一步的加工处理。从T7-LC3生成的LC3-II的膜分布与内源LC-II相似。T7-LC3-II的生成需要与内源性LC3-II生成先相同的条件,如如MTORC1-ULK1激活、PI3K激活、PI3P结合、胞质A、胞质A、胞质A。

    二、鉴定触发LC3脂化的膜来源

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    在验证了体外脂化实验的有效性后,研究者先用差速离心法从细胞中分离出4种膜组分(上图)并用各种细胞器标记蛋白鉴定组成成分。将这4种膜分别与WT MEFs的细胞质混合孵育,测定生成的LC3-II的量(结果如下图)。

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    结果表明25K组分的LC3脂化活性最高,且25k组分富含过氧化物酶体标记物(PMP70)、晚期内体标记物(LAMP2)和顺面高尔基体标记物(GM130),也含有ERGIC标记物(ERGIC53、SEC22B)、细胞膜标记物(TFR)、内质网标记物(RPN1)、ER释放位点(SEC12)、溶酶体标记物(Cathepsin D)和A(自噬泡前体膜的一种标记物)。

    为了进一步分析25k组分中的膜来源,研究者用蔗糖梯度离心法将25k组分分为轻(L)和重(P)两部分。同样的方法测定LC3脂化情况。

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    L组的LC3脂化活性最强,ERGIC、cis-Golgi和A-阳性囊泡中占L的比重较大。

    再次细分L组分,脂化活性几乎与SEC22B、ERGIC53阳性生物膜共富集(图7B)。

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    图7B中的ERGIC膜中并未富集诸如A、A、A、A。

    为了判断ERGIC是否是LC3脂化的必备膜来源,研究者用SEC22B抗体将ERGIC膜从L组分中提出,发现SEC22B和ERGIC53均减少,其他标记物未受到影响,LC3脂化活性降低至原来的1/3。相反,用SEC22B或KDEL受体抗体(KDELR,另一种ERGIC标记物)从细胞中分离ERGIC膜,发现LC3-II的脂化能力分别上升了2倍和5倍。

    因此,ERGIC是LC3脂化活性最高的膜底物。

    三、ERGIC是LC3脂化的重要膜来源

    为了进一步判断ERGIC在LC3脂化中的作用,研究者在细胞培养基中添加了PKA抑制剂(H89,高浓度时抑制COPII囊泡生成)或Brefeldin A(ARF1激活抑制剂),处理后观察ERGIC和高尔基体标记物的分布变化。当使用低浓度的H89抑制剂时,ERGIC53或GM130的分布没有收到影响。BFA处理导致高尔基体裂解成小点,与ERGIC53共定位。BFA处理后再用高浓度H89处理,ERGIC53和GM130都呈弥散分布。处理后的细胞膜被用于体外脂化实验(细胞质源于饥饿处理的细胞),只有H89高浓度处理组LC3脂化能力丢失。

    Clofibrate是一种过氧化物激活受体拮抗剂,可以抑制ER-Golgi的运输,促进高尔基体的囊泡转回内质网。Clofibrate处理导致ERGIC53和GM130的弥散。类似H89高浓度处理,clofibrate处理导致LC3脂化能力丢失。作为对照,kbNB142-70(PKD抑制剂)和Pitstop2(一种网格蛋白抑制剂)对LC3脂化的影响很小。

    H89和clofibrate可以诱导ERGIC膜到ER的转运,这个过程需要微管参与,添加nocodazole破坏微管保证ERGIC的点状分布,结果H89和clofibrate对LC3脂化的抑制效应得到解除。对这种回复过程作动态观察(处理诱导ERGIC破坏,加入普通培养基培养使ERGIC慢慢回复),结果如下图,LC3的脂化活性随ERGIC的恢复而恢复。

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    四、ERGIC被自噬起始所需

    在完整的自噬诱发过程中鉴定ERGIC与自噬起始的关系。非饥饿处理下LC3呈弥散分布,饥饿处理导致LC3形成点状分布,高浓度H89和clofibrate抑制点状分布形成。上文已知高浓度H89和Clofibrate抑制ERGIC形成,另一种已知的定位于早期自噬泡的标记物A。H89也可以抑制PKA,为了排除PKA的影响,用低浓度的H89处理没能达到高浓度处理一样的效果(低浓度H89处理对ERGIC形成影响较小),并且低浓度H89处理反而使LC3脂化活力略微增高(与前期抑制PKA诱导自噬的研究相吻合)。

    在细胞中引入SAR1A GTPase的两种突变体抑制COPII囊泡的生成,引入突变后ERGIC53呈弥散分布,表明ERGIC受到破坏。引入突变组中饥饿处理无法诱导LC3阳性小点的生成。

    五、ERGIC招募A

    A,诱发早期自噬的发生。自噬被诱导后,A。高浓度H89处理导致A。引入SAT1A突变体后结果相似,表明ERGIC的正常功能为A。在体外LC3脂化实验(饥饿处理的HEK293细胞胞质+高浓度H89处理后的Atg5 KO MEFs细胞膜)中添加标签标记的A,孵育一段时间后,取膜成分提取蛋白质,免疫印迹法观察A。高浓度H89处理导致A。

    饥饿处理后A(下图)。

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    讨论:

    1、ERGIC的整体还是部分结构对LC3脂化起作用?

    笔者读完这篇论文后,认为可能是部分结构对LC3的脂化起作用。因为图12补充图2中ERGIC53的面积远大于有共定位的A。A,在自噬起始过程中十分重要,是早期信号。A。

    2、LC3的定位是否与ERGIC53重合?

    文中未提供相关证据。假如认为ERGIC是LC3脂化的膜来源,理论上LC3-II阳性囊泡上会带有ERGIC相关分子标记物或在空间上与ERGIC相邻。

    3、A?

    文中未提供相关证据,有待研究。

    4、A,PI3K的主要功能由VPS34和VPS15决定,A。类比更上游的ULK复合物,A、FIP200和A?

    文中未提供相关证据,有待研究。

    5、100k组分中有没有其他能够促进LC3脂化的成分?

    100k的LC3脂化活性仅次于25k,后续第二和第三步离心只取了25k组分,因此没有证据表明100k中没有促进LC3脂化的细小膜结构。


    实际上,论文作者在这篇文章的基础上还做了更多工作,预知后事如何,请听下回分解。

    【1】Wiki-Autophagy:https://en.wikipedia.org/wiki/Autophagy

    【2】Levine B, Kroemer G. Biological functions of autophagy genes: A disease perspective[J]. Cell, 2019, 176(1): 11-42.

    【3】Ge L, Melville D, Zhang M, et al. The ER-Golgi intermediate compartment is a key membrane source for the LC3 lipidation step of autophagosome biogenesis[J]. ELife, 2013, 2e947.

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